Химическая биология

Когда Стивен Беннер начинал работать над перестройкой генетических молекул, он был не лучшего мнения о ДНК. «Первое, что приходит вам на ум, это то, что она создана довольно бессмысленно», — говорит Беннер, биологический химик из Фонда прикладной молекулярной эволюции в Гейнсвили, Флорида.

Возьмем скелет ДНК, содержащий повторяющиеся, отрицательно заряженные фосфатные группы. Отрицательные заряды отталкиваются друг от друга, поэтому это свойство должно ухудшать способность двух нитей ДНК соединяться и образовывать двойную цепочку. Поэтому в ней присутствуют две пары соединений: аденин (А) с тимином (Т) и цитозин (С) с гуанином (G). Обе пары соединяются за счет водородных связей, однако такие связи непрочны и легко разрушаются водой — а воды в клетке достаточно. «Ваше драгоценное генетическое наследство, который вы передаете своим детям — или вы доверили бы его водородным связям в воде? — Спрашивает Бенгер. — Если бы вы были химиком, нацеленным на создание такой штуки, то наверняка не стали бы этого делать».

В жизни были свои причины, чтобы использовать именно такую структуру, однако это не остановило Бэннера и других от попыток ее изменить. В течение последних десятилетий, они работали над основными блоками ДНК и создал целый зоопарк различных экзотических букв, кроме А, Т, С и G, которые можно похожим образом сочетать в пары и копировать. Однако в работе постоянно возникали какие-то проблемы, говорит Беннер. Сейчас лишь несколько таких неестественных базовых пар можно последовательно ввести в ДНК, а клетки еще не способны полностью принять чужую биохимию.

Перестройка ДНК и ее сестры, РНК, имеет свои практические цели. Искусственные пары оснований уже использовались для выявления вирусов и могут найти широкое применение в медицине. Однако ученых также двигает вперед и чистая новизна отрасли. В частности, они надеются создать организмы с большим «генетическим алфавитом», где можно будет хранить больше информации, или даже такие, чей геном вообще не будет иметь естественных «букв». Создавая такие формы жизни, исследователи смогут понять больше о фундаментальных ограничений структуры генетической молекулы и определить, природные основы обязательные для жизни, или это просто один из многих возможных решений. «На Земле биология пошла одним путем, — говорит Джеральд Джойс, биохимик ядер и кислот в Исследовательском институте имени Скриппса в Ла Хойи, Калифорния. — Однако в принципе, того же результата можно достичь и другими способами».

Беннер впервые заинтересовался этими другими способами еще в 1970 году, когда был аспирантом. Химики синтезировали все, от пептидов к ядам, а некоторые даже пытался создать молекулы, которые могли бы выполнять те же роли, что и природные энзимы или антитела с различными химическими структурами. Однако ДНК в основном игнорировали, как вспоминает ученый. «Химики смотрели на перспективу создания любого другого класса молекул, кроме центральной для биологии», — говорит Беннер.

В 1986 году Беннер открыл свою лабораторию в Швейцарском национальном технологическом институте в Цюрихе и начал перестраивать основу ДНК. Он быстро пришел к мысли, что то, что казалось недостатком, может действительно быть особенностью. Когда он и его команда заменили отрицательно заряженные фосфаты в основе на нейтральные химические группы, то увидели, что любою цепочку, длиннее дюжины элементов закручивался сам на себя — возможно, сила отталкивания зарядов нужна для того, чтобы молекула оставалась вытянутой .

Основы оказались податливыми для работы. Беннер нацелился на создание пар оснований, похожих на природные, но с измененными водородными связями.

Его команда проверила две новые пары: изо-С и изо-G , а также κ и ксантозин. Испытания показали, что энзимы полимеразы — копирующих ДНК или транскрибируют ее в РНК — могут прочитать ДНК, содержащей ложные основы и вставить соответствующие пары в создаваемую нить ДНК или РНК. Рибосомы, клеточные машины, которые «транслируют» РНК в белки, также могут прочитать фрагмент РНК, содержащий изо-С и использовать его для добавления неестественной аминокислоты в белок, строится. «Похоже, что центральный генетический процесс — спаривания основ — стал для нас наиболее уязвимой частью молекулы», — говорит Беннер. Но исследователи все равно оказались перед проблемой. Так как атомы водорода пытались изменить свое положение, изо-G довольно часто превращался в другую форму и дополнялся Т вместо изо-С.

Неестественные связи

Химик Эрик Коол, который сейчас работает в Стэнфордском университете в Калифорнии, спрашивает себя, может ли его команда создать неестественные основы с зафиксированными существующими водородными связями. Он с коллегами сделали основу, похожую на естественной основы Т, однако вместо атомов кислорода в ней фтор , а также некоторые другие различия . Структура новой основы, которую назвали дифлуоротолуен (или просто F), почти точно повторяет форму Т, однако не дает водороду менять свое положение.

Команда быстро определила, что F создает водородные связи просто ужасно, однако полимеразы все равно определяли его как Т: при копировании ДНК, они точно дополняли пару А — F и наоборот. Работа может говорить о том, что поскольку основа имела правильную форму, полимераза смогла правильно подыскать ей пару. «Если ключик подходит, он работает», — говорит Коол.

Другие ученые сомневаются. «Я получил возмущеные письма от людей, которые говорили — как вы вообще можете говорить, что водородные связи не нужны для репликации ДНК, — говорит Коол. — Это был центральный момент всей спирали. А люди так сильно сосредоточились на водородных связях, им было даже трудно представить альтернативы ». Вместо формировать водородные связи — их обычно ассоциируют с гидрофильными молекулами — F и другие созданные Коолом основы, которые повторяют форму естественных структур, были гидрофобными. Вода их отталкивала, что помогало им стабилизироваться в двойной спирали. ДНК похожая на стопку монет, говорит Коол, а пребывание в структуре защищает неестественные основания от воды.

Флойд Ромесберг, химический биологи из Исследовательского института имени Скриппса пополнил список гидрофобных основ. Начав двигаться от таких молекул, как бензол и нафталин, его команда создала «все возможные производные», говорит он. «Это нас отвел довольно далеко от того, что вообще можно было бы называть естественной основой». Однако проверяя репликации, исследователи обнаружили две противоречивые требования. Определяющее место в основе быть гидрофобным для энзимов для того, чтобы они могли встроиться в ДНК, хотя оно же могло образовывать водородные связи, если энзимы продолжали копировать цепочку.

Команда Ромесберга просмотрела 3 600 комбинаций 60 Основ, чтобы найти пару, которая копировалась наиболее эффективно и точно. Две победительницы, MMO2 и SICS, «набрали одинаковое количество баллов» в гидрофобности и гидрофильности в ключевой позиции, говорит Ромесберг.

Но все равно впереди оставалось большое испытание: исследователи должны были показать, что ДНК все равно содержат неестественные пары после миллиардов копий. Если энзимы будут слишком часто спаривать неестественные основы с естественными, то новые «буквы» могут исчезнуть со временем.

Различные трюки с основами

Ичиро Хираи, химик из Центра систем и структурной биологии RIKEN, находящийся в Иокогаме, Япония был заинтригован идеей создания неестественных основ после того, как еще подростком прочитал книгу Джеймса Ватсона «Двойная спираль». Хираи с коллегами обнаружили, что они могут уменьшить количество случаев неправильного спаривания, создавая такие формы, которые почти не похожи на природные основы а также добавляя отрицательно заряженные или богатые электроны химической группы, которые отражают естественные основы соответствующих частей. Команда Хираи доложила, что ДНК, содержащей ложные гидрофобные пары оснований, названные Ds и Diol1-Px, может правильно копироваться в 99,77 — 99,92% случаях репликации. В том же году, Беннер с коллегами показали, что другая неестественная пара основ — P и Z, которая соединяется водородными связями — достигла правильности у 99,8% репликаций. А в июле команда Ромсберга доложила о достижениях 99,66 — 99,99% правильности в репликации для оптимизированной версии основ, которые они назвали NaM и 5SICS, что превышает наиболее неуклюжий уровень для природных ДНК. «Наш лучший результат наконец приближается к худшему в природе», — говорит Ромесберг.

Однако неестественным основам еще многое нужно доказать. Исследователи не показали, что полимеразы могут копировать более четырех из парных основ подряд. Беннер называет полимеразы «крепким орешком».

Филипп Холлигер, химический биолог из Лаборатории молекулярной биологии Медицинского исследовательского совета в Кембридже, Великобритания и его коллеги показали подобной подход ранее в этом году — используя нуклеиновые кислоты под названием XНК (ксено-нуклеиновые кислоты, англ. XNA), в которых сахара, обычно присутствуют в ДНК и РНК, заменены на другие кольцевые структуры. Команда создала миллиарда мутантов естественной полимеразы и позволила им эволюционировать, избирательно воздействуя на них, чтобы они превратили ДНК на ХНК. После этого исследователи сравнили наиболее эффективных мутантов, чтобы определить среди них лучшего. Полимераза по форме была несколько похожей на ладонь, и ее «большой палец» оказался ключевой областью, которой пришлось меняться, говорит Холлигер. Эта область контактирует с ДНК, когда выводит энзим и может играть роль последней точки для обеспечения правильного синтеза. Команда также создала энзим, который может превратить ХНК обратно в ДНК.

До сих пор большинство такой работы проводилась в пробирке, однако исследователи надеются показать, что организмы могут считывать и обрабатывать такую информацию. Возможно, случаем наибольшего приближения к введению неестественных баз в живую систему было создание искусственной бактерии, о котором в прошлом году доложил  Филипп Марлиер, соучредитель компании Heurisko в Ньюарке, Делавар. Он и его команда заменили большинство Т основ организма на хлор-урацил, вид основания урацила РНК, в которой атом водорода заменен хлорин. Команда разработала автоматизированную систему для постепенного введения основы в штамм бактерии Escherichia Coli , которая не могла сама создавать тимин. Примерно через пять месяцев, несколько бактерий не могли жить без хлор-урацила и вывели примерно 90% тимина из своего генома.

Беннер, Ромесберг и Хира также работают над тем, чтобы уговорить клетки принять у себя их пары оснований. Однако даже тогда, когда клетки делают это, могут возникнуть проблемы, например, в рекомбинации — высокоорганизованной перестановке генетического материала. «Дело не заканчивается на том, чтобы ввести эти проклятые штуки, — говорит Эндрю Веллингтон, биохимик из Университета Техаса в Остине и в прошлом — аспирант Бэннера. — Я считаю, что это лишь скромная часть геркулесовой подвига, который еще предстоит сделать».

Неизвестно даже, как далеко зайдут исследователи. Команда Марлиера надеется заменить все природные основы на неестественные. Однако Ромесберг говорит, что создать организм исключительно с гидрофобными основами почти невозможно, поскольку клетки содержат слишком много компонентов, которые адаптировались к работе с естественными основаниями. Что касается комбинации неестественного скелета и неестественных основ в одном организме, то «наша теория еще недостаточно хороша, чтобы мы могли сделать обе вещи одновременно», — говорит Беннер.

Даже если неестественные пары оснований еще не функционируют в клетках, их все равно можно использовать на практике. Компания Siemens Healthcare Diagnostics в Теритауни, штат Нью-Йорк, а также компания Luminex в городе Остин, Техас, уже используют пару изо-C и изо-G Беннера для лучшего выявления и слежения за вирусными инфекциями. Например, Siemens использует ряд последовательностей ДНК, которые приклеиваются к РНК ВИЧ-1 в образце крови пациента. Введение неестественных основ в некоторые последовательности препятствует последовательностям привязываться к случайных последовательностей ДНК в образце и позволяет легче выявить РНК ВИЧ-1 и в меньших количествах.

Молекулы ДНК и РНК также могут ускорять реакции и использоваться в качестве лекарств. Разработчики могут улучшить характеристики последовательности, добавляя химические группы к основам, а искусственные основания делают определение отдельного места в последовательности легче, чем сатурация каждого C или G. Команда Ромесберга добавила группы «соединителей» в неестественных оснований в ДНК, что позволяет им точно присоединяться к различным молекул. Сегодня команда пытается создать последовательности, ускорять реакции более эффективно, чем их природные аналоги.

Хираи говорит, что его команда создала последовательности ДНК, содержащих основу Ds, которая намного лучше природной последовательности присоединялась к гамма-интерферона, протеина иммунной системы, и к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), который является терапевтическими целями в лечении онкологических и глазных заболеваний.

Кроме практического использования, исследователи также продолжает толкать вперед, что Коол назвал «призывом научной фантастики» к созданию и даже улучшения живых систем. Ранние жизненные формы на Земле могли создать свою генетическую азбуку просто потому, что их использование было мало вариантов химических элементов. Например, аденин легко создается с цианида водорода, который, скорее всего, существовал во времена, когда зародилось первая жизнь. Только организмы получили работающий набор основ, возможно, они замкнулись на этой системе. «Если начинаешь слишком сильно вмешиваться в основы биохимии, то тебя съедят», — говорит Беннер. Хотя РНК — считается предшественницей ДНК — может быть не лучшим решением по поддержке информации о жизни, это могло быть лучше с тогда возможных, возникшее на до-биологической Земли, считает Беннер.

Поэтому если нуклеиновые кислоты могут независимо возникнуть на другой планете, будут ли они одинаковые с нашими основы? Беннер считает, что нет, разве что на организмы влияли те же ограничения. В то же время могут иметь место и некоторые универсальные правила. Например, Беннер говорит, что скелеты с повторяющимися зарядами — которые он сначала считал обязательными — на самом деле препятствуют фолдинг и обеспечивают похожее поведение нитям с различными последовательностями оснований при таких процессах, как репликация. Хотя некоторые исследователи смогли добиться успеха с альтернативными основами, в результате многих попыток возникли слишком жесткие или слишком слабы молекулы, которые не могли создать спираль. «Я думаю, что в химических вариациях, которые можно ввести, есть определенный предел», — говорит Холлигер.

04.05.2015

Поделиться в соц. сетях

Опубликовать в Google Buzz
Опубликовать в Google Plus
Опубликовать в LiveJournal
Опубликовать в Мой Мир
Опубликовать в Одноклассники

Добавить комментарий